埃德曼降解法
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Edman降解(埃德曼降解,英語:Edman degradation),也根據所使用試劑而被稱為「PTC法」或「PTH法」,是肽鏈或蛋白質中N-端胺基酸序列分析方法之一。由菲爾·埃德曼(Pehr Edman)首先創立。[1]
機理
![埃德曼降解(Edman degradation)的機理。](http://images.weserv.nl/?url=//upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/8/8f/EdmanDegradationZh.png/600px-EdmanDegradationZh.png)
用異硫氰酸苯酯(Phenylisothiocyanate, 縮寫:PITC)與待分析多肽的N-端胺基在鹼性條件下反應,生成苯硫脲(PTC)的衍生物,於酸性條件之下生成五元環,肽鏈N-端被選擇性地切斷,得到N-端胺基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。接著用有機溶劑將該衍生物萃取出來,酸作用下,該衍生物不穩定,會繼續反應,形成一個穩定的苯基乙內醯硫脲(PTH)衍生物。餘下肽鏈中的醯胺鍵不受影響。通過用HPLC或電泳法分析生成的苯乙內醯硫脲(PTH-胺基酸),可以鑑定出是哪一個胺基酸。每反應一次,結果是得到一個去掉N-端胺基酸殘基的多肽,剩下的肽鏈可以進入下一個循環,繼續發生降解。
在1967年就出現了實現根據此原理設計的自動化儀器。[2]利用自動分析儀進行分析時,能夠可靠地測定肽鏈的30個左右胺基酸殘基序列,最多可以分析50-60個胺基酸殘基。在最好的條件下,每形成一次PTH-胺基酸,效率可保持在99%以上。而且此法用量少,一般只用10-100皮莫耳的多肽即可測定胺基酸序列。對於肽鏈較長的多肽,可以先將肽鏈切斷成多個小肽,對這些小肽進行胺基酸分析,然後將這些資訊拼接起來,得到起始肽鏈中的胺基酸序列。
限制
由於Edman降解是以化學試劑對N-端胺基的修飾為基礎的,因此當N-端被其他化學基團所封閉時,就需要先去除這些基團,然後才能進行定序。此外,蛋白質中含有半胱胺酸殘基時,有時兩個半胱胺酸殘基會發生二硫鍵交聯。這種情況下,需要先用過酸將二硫鍵氧化為–SO3H,然後才能用Edman降解測定序列。
另外,由於所有反應都在封閉或體外的環境之下,勢必會達到平衡,因此若在第一個試管裡加入PITC,它會和試管內的第一個胺基酸的N-端胺基結合,可是由於平衡原理:PITC + 一段胺基酸序列 = PITC-胺基酸 + 少了第一個胺基酸的胺基酸序列,因此在第一個試管裡會同時存在沒有結合PITC和有結合PITC的胺基酸序列,這會導致我們將第一管有PITC-胺基酸的物質分離後,繼續在第二個試管裡加入PITC,則此時第二個試管裡會含有少量的PITC-胺基酸(1)和多量的PITC-胺基酸(2)。這時候我們可以利用聯用質譜法(Tandem mass spectrometry (頁面存檔備份,存於網際網路檔案館))等技術來分析,若分析後發現量多者為PITC-胺基酸(2),量少者則為PITC-胺基酸(1),因此我們就解決了反應不完全的問題。而另外一個問題也隨之衍生,一旦我們不停地重複此步驟,得到胺基酸的序列時,一直到約第50個試管開始,就會發現所以胺基酸的量經分析後都會變得幾乎一樣,這樣我們就沒有辦法可以知道胺基酸的序列。這也就是為什麼我們需要先將一段大於50個胺基酸的序列用水解酶給進行切割,讓所有片段的胺基酸序列小於50,這樣我們才可以得到比較準確的胺基酸序列。
參見
參考資料
- ^ Edman, Pehr; Högfeldt, Erik; Sillén, Lars Gunnar; Kinell, Per-Olof. Method for Determination of the Amino Acid Sequence in Peptides.. Acta Chemica Scandinavica. 1950, 4: 283–293. ISSN 0904-213X. doi:10.3891/acta.chem.scand.04-0283.
- ^ Edman, P.; Begg, G. A Protein Sequenator. European Journal of Biochemistry. 1967, 1 (1): 80–91. ISSN 0014-2956. doi:10.1111/j.1432-1033.1967.tb00047.x.