反相色譜法
逆向層析（英語：Reversed-phase chromatography，RPC）包含了任何一種使用非極性固定相的色譜學方法[1]。「反相」這個詞有著其歷史背景。在1970年代，大多數液相色譜是在未修飾的氧化矽或氧化鋁上完成的，他們表面的化學性質是親水性的，對於極性化合物具有更強的親和力，因此也叫做「正相」（正常）色譜。若採用烷基鏈共價鍵合到支持表面上，則會倒換洗脫順序[2]。在反相色譜法中，極性化合物先被洗脫出來，而非極性化合物被保持住，因為它們親和於反相表面。在其他色譜方法中所使用的所有數學與試驗研究在反相色譜中亦適用（例如色譜解析度與柱長成正比）。如今，反相柱色譜法在分析型液相色譜中占絕大多數比例。
固定相
基於二氧化矽的固定相
任何達到足夠填料程度的惰性非極性物質都可被用於製作反相色譜。最廣泛使用的色譜柱是鍵合了十八烷基碳鏈（C18柱）的氧化矽（USP分類為L1），現有297種商業化的色譜柱[3]。其後的編號有鍵合八烷基碳鏈的氧化矽C8柱（L7 - 166種色譜柱）、純氧化矽柱（L3 - 88種色譜柱）、鍵合氰基的氧化矽柱（L10 - 73種色譜柱）與鍵合苯基的氧化矽柱（L11 - 72種色譜柱）。需要注意的是：C18柱、C8柱與苯基柱用的都是反相填料，而氰基柱可被用於反相色譜模式，這取決於分析物與流動相條件。並不是所有C18柱具有相同的保留性質，這點是值得注意的問題。使氧化矽與有機矽烷之間進行單體反應或聚合反應後，這用於生產色譜柱的第二階段中，可使得氧化矽表面的官能化，以使剩餘未鍵合的矽烷醇基也被覆蓋起來（末端加帽）。不同固定相的表面化學性質的微妙改變會導致選擇性的改變，然而總體的保留機制依然相同。
流動相考量
水或緩衝液與有機溶劑的混合物常備用於從反相柱上洗脫分析物。這些有機溶劑必須與水互溶，故常用的有機溶劑是：乙腈、甲醇與四氫呋喃（THF）。其他溶劑如乙醇或2-丙醇（異丙醇）亦可被使用。洗脫的施行方法有：等強度洗脫（在分離過程中水-溶劑組分始終不變）或使用梯度洗脫（在分離過程中水-溶劑組分會變化）。流動相的pH在一種分析物的保留上起著關鍵的作用，並且會改變對於特定分析物的選擇性。帶電的分析物可以經由使用離子對（亦稱為離子互作用）的方法在反相柱上分離下來。此項技術亦被稱作反相離子對色譜。
參考文獻
- ^ 國際純化學和應用化學聯合會，化學術語概略，第二版。（金皮書）(1997)。在線校正版: (2006–) "reversed-phase chromatography"。doi:10.1351/goldbook.R05376
- ^ I. Molnar and C. Horvarth, Clin.Chem., 22 (1976) 1497.
- ^ Chromatographic Reagents Used in USP - NF and Pharamcopeial Forum, (2007 edition).
