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RNA干擾

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慢病毒遞送設計的shRNA和在哺乳動物細胞中的RNA干擾的機制。
RNAi示意圖

RNA干擾（RNA interference，縮寫為RNAi）是指一種分子生物學上由雙鏈RNA誘發的基因沉默現象，其機制是通過阻礙特定基因的轉錄或轉譯來抑制基因表達。當細胞中導入與內源性mRNA編碼區同源的雙鏈RNA時，該mRNA發生降解而導致基因表達沉默[1]。與其它基因沉默現象不同的是，在植物和線蟲中，RNAi具有傳遞性，可在細胞之間傳播，此現象被稱作全身性RNA干擾（systemic RNAi）[2][3]。在秀麗隱杆線蟲上實驗時還可使子一代產生基因突變，甚至於可用餵食細菌給線蟲的方式讓線蟲得以產生RNA干擾現象。RNAi現象在生物中普遍存在。2006年，安德魯·法厄（Andrew Z. Fire）與克雷格·梅洛（Craig C. Mello）由於在秀麗隱杆線蟲的RNAi機制研究中的貢獻而共同獲得諾貝爾生理及醫學獎。

RNAi與轉錄後基因沉默（post-transcriptional gene silencing and transgene silencing）在分子層次上被證實是同一種現象[來源請求]。

發現

在轉基因的矮牽牛花中所觀察到的RNA干擾現象[4]

RNA干擾現象是1990年由約根森（Jorgensen）研究小組在研究查爾酮合成酶對花青素合成速度的影響時所發現，為得到顏色更深的矮牽牛花而過量表達查爾酮合成酶，結果意外得到了白色和白紫雜色的矮牽牛花，並且過量表達查爾酮合成酶的矮牽牛花中查爾酮合成酶的濃度比正常矮牽牛花中的濃度低50倍。約根森推測外源轉入的編碼查爾酮合成酶的基因同時抑制了花中內源查爾酮合成酶基因的表達[5]。

1992年，羅馬諾（Romano）和Macino也在粉色麵包黴菌中發現了外源導入基因可以抑制具有同源序列的內源基因的表達[6]。1995年，Guo和Kemphues在線蟲中也發現了RNA干擾現象[7]。

1998年，安德魯·法厄（Andrew Z. Fire）等在秀麗隱杆線蟲（C.elegans）中進行反義RNA抑制實驗時發現，作為對照加入的雙鏈RNA相比正義或反義RNA顯示出了更強的抑制效果[1]。從與靶mRNA的分子量比考慮，加入的雙鏈RNA的抑制效果要強於理論上1:1配對時的抑制效果，因此推測在雙鏈RNA引導的抑制過程中存在某種擴增效應並且有某種酶活性參與其中。並且將這種現象命名為RNA干擾。

2006年，安德魯·法厄與克雷格·梅洛（Craig C. Mello）由於在RNAi機制研究中的貢獻獲得諾貝爾生理及醫學獎。

機制

siRNA

RNA干擾現象的機理[8]

RNA干擾作用是通過一類較穩定的中間介質實現的。對植物的研究證明，雙鏈RNA複合體先降解成為35nt左右的小RNA分子，然後他們通過序列互補與mRNA結合，從而導致mRNA降解[9][10]。對果蠅的研究證明，長度為21～23nt的小RNA分子是引起RNA干擾現象的直接原因[11][12]。這種小RNA分子被稱之為小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）。

在RNA干擾中一個非常重要的酶是RNaseIII核酶家族的Dicer。它可與雙鏈RNA結合，並將其剪切成21～23nt及3'端突出的小分子RNA片段，即siRNA。隨後siRNA與若干個蛋白組成的，RNA引起的稱之為RNA誘導沉默複合體（RNA-induced silencing complex，簡稱RISC）結合，解旋成單鏈，並由該複合體主導RNAi效應[13]。RISC被活化後，活化型RISC受已成單鏈的siRNA引導（guide strand），序列特異性地結合在標靶mRNA上並切斷標靶mRNA，引發靶mRNA的特異性分解。

迄今為止已鑑定出包括Dicer在內的若干個與RNAi有關的蛋白因子[來源請求]。在果蠅（Drosophila melanogaster）RISC中，已知存在着稱為Argonaute2（AGO2）的因子，AGO2蛋白的表達受到抑制時，RNAi效應缺失，也就是說AGO2是果蠅RNAi機制的必須因子[來源請求]。研究表明Argonaute家族蛋白具有RNA切割酶活性（slicer activity），RNAi機制正是由Argonaute家族蛋白的RNA切割酶活性主導[來源請求]。另外，幾個RNA解旋酶（RNA helicase）也被鑑定為參與RNAi機制的因子[來源請求]。在秀麗隱杆線蟲（C. elegans）的RNAi中必須的因子有EGO1[來源請求]，這是一種RdRP（RNA-dependent RNA Polymerase），植物中也存在該蛋白同系物。RNAi中RdRP是將標靶mRNA作為模板，以導入的dsRNA（或siRNA）作為引子合成RNA，在細胞內針對於標靶mRNA合成新siRNA的酶。這一反應在一些生物的RNAi中為必須，但RdRP活性在人和果蠅的RNAi中是非必須的，這說明在不同物種之間RNAi機制的基本框架雖然相同，但存在着微妙差異[來源請求]。

microRNA

在真核生物當中，還存在另外一種小分子RNA（microRNA）也能引起RNA干擾現象。microRNA大多20-22nt長，前體具有類似髮夾性的莖環結構。microRNA產生於該莖環結構的雙鏈區。其特點與siRNA基本上相同[14]。

RNA干擾的作用

2001年，Tuschl等將siRNA導入到哺乳動物細胞中並由此解決了在哺乳細胞內導入長的雙鏈RNA時引發的干擾素效應，由此拓展了RNAi在基因治療上應用前景[來源請求]。RNAi機制普遍存在於動植物，尤其是低等生物中[15]。因此被認為是進化上相對保守的基因表達調控機制[來源請求]。一種假說為[15]，RNAi機制是作為在RNA水平上抵禦病毒入侵的防禦機制而存在的。在病毒自身基因組所包含的，或在病毒複製過程中產生的雙鏈RNA可以被Dicer識別，從而引起病毒RNA降解。但是許多病毒為抵抗宿主的RNA干擾機制，會產生抑制宿主RNA干擾的蛋白，以保護病毒基因在宿主體內的順利複製。已經發現的可以抑制宿主RNA干擾的病毒蛋白有potyviruses編碼的HC-PRO蛋白、馬鈴薯X病毒編碼的Cmv2b蛋白、獸棚病毒編碼的B2蛋白等[16]。

RNA干擾也是抑制破壞基因結構的一種DNA片段轉錄子活性的重要方式。轉錄子通常以逆轉錄的方式在基因組中擴增。在逆轉錄過程中產生的雙鏈RNA分子可以被Dicer識別，從而被降解[15]。

目前發現[來源請求]，RNAi機制中的相關一些因子如內源性雙鏈RNA及蛋白因子可以在多種層次上對基因表達進行調控，其範圍已經超越了PTGS（post transcriptional gene silencing），如RNAi機制同樣參與了轉錄水平上的基因表達調控過程中。

應用

RNAi在基因靜默（silent gene）方面具有高效性和簡單性，所以是基因功能研究的重要工具。

大多數藥物屬於標靶基因（或疾病基因）的抑制劑，因此RNAi模擬了藥物的作用，這種功能丟失（LOF）的研究方法比傳統的功能獲得（GOF）方法更具優勢。因此, RNAi在今天的製藥產業中是藥物靶標確認的一個重要工具。同時，那些在靶標實驗中證明有效的siRNA/shRNA本身還可以被進一步開發成為RNAi藥物。

在藥物標靶發現和確認方面，RNAi技術已獲得了廣泛的應用。生物技術公司或製藥公司通常利用建立好的RNAi文庫來引入細胞，然後通過觀察細胞的表型變化來發現具有功能的基因。如可通過RNAi文庫介導的腫瘤細胞生長來發現能抑制腫瘤的基因[來源請求]。一旦所發現的基因屬於可用藥的靶標（如表達的蛋白在細胞膜上或被分泌出細胞外），就可以針對此靶標進行大規模的藥物篩選。此外，被發現的靶標還可用RNAi技術在細胞水平或動物體內進一步確認[來源請求]。

在疾病治療方面，雙鏈小分子RNA或siRNA已被用於臨床測試用於幾種疾病治療，如老年視黃斑退化、肌肉萎縮性側索硬化症、類風濕性關節炎、肥胖症等。在抗病毒治療方面，帕金森病等神經系統疾病已經開始初步採用RNA干擾療法。腫瘤治療方面也已經取得了一些成果[17]。

參考文獻

引用

  1. ^ 1.0 1.1 Fire A, Xu S, Montgomery M, Kostas S, Driver S, Mello C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 1998, 391 (6669): 806–11. PMID 9486653. 
  2. ^ Winston, William M. Systemic RNAi in C. elegans Requires the Putative Transmembrane Protein SID-1. Science. March 2002, 295: 2456. 
  3. ^ Jae-Yean, Kim. Regulation of short-distance transport of RNA and protein. Current Opinion in Plant Biology. February 2005, 8: 45. 
  4. ^ Matzke MA, Matzke AJM. Planting the Seeds of a New Paradigm.. PLoS Biol. 2004, 2 (5): e133. PMID 15138502. 
  5. ^ C, Napoli C; Lemieux C, Jorgensen R. Introduction of a Chimeric Chalcone Synthase Gene into Petunia Results in Reversible Co-Suppression of Homologous Genes in trans. Plant Cell. 1990, 2 (4): 279–289 [2007-07-09]. PMID 12354959. （原始內容存檔於2007-10-23）. 
  6. ^ Macino G, Romano N. Quelling: transient inactivation of gene expression in Neurospora crassa by transformation with homologous sequences. Mol Microbiol. 1992, 6 (22): 3343–3353. PMID 1484489. 
  7. ^ Kemphues KJ, Guo S. par-1, a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos, encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed. Cell. 1995, 81 (4): 611–620. PMID 7758115. 
  8. ^ Maurizio Provenzano, Simone Mocellin. RNA interference: learning gene knock-down from cell physiology. Journal of Translational Medicine. 2004, 2: 39. doi:10.1186/1479-5876-2-39. （原始內容存檔於2007-06-30）. 
  9. ^ Baulcombe DC, Voinnet O. Systemic signalling in gene silencing. Nature. 1997, 389 (6651): 553. PMID 9335491. 
  10. ^ David C. Baulcombe, Andrew J. Hamilton. A Species of Small Antisense RNA in Posttranscriptional Gene Silencing in Plants. Science. 1999, 286 (5441): 950–952. doi:10.1126/science.286.5441.950. 
  11. ^ E Bernstein, S M Hammond; D Beach , G J Hannon. An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells. Nature. 2000, 404 (6775): 293–296. PMID 10749213. 
  12. ^ Tuschl T, Zamore PD; Sharp PA, Bartel DP. RNAi: double-stranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals. Cell. 2000, 101 (1): 25–33. PMID 10778853. 
  13. ^ Caudy AA, Bernstein E; Hammond SM, Hannon GJ. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 2001, 409 (1818): 363–6. PMID 11201747. 
  14. ^ DP, Bartel. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 2004, 116 (2): 281–97. PMID 14744438. 
  15. ^ 15.0 15.1 15.2 RNA干扰：双链RNA引起的基因沉默机制——2006年诺贝尔生理学或医学奖成果简介. 科技導報. 2006, 24 (12): 5–8.  Authors list列表中的|first1=缺少|last1= (幫助)
  16. ^ Ding SW, Li WX. Viral suppressors of RNA silencing. Curr Opin Biotechnol. 2001, 12 (2): 150–4. PMID 11287229. 
  17. ^ Uprichard, Susan L. The therapeutic potential of RNA interference. FEBS Letters. 2005, 579 (26): 5996–6007. doi:10.1016/j.febslet.2005.08.004. 

來源

期刊文章
  • Recent develpment of RNAi in drug target discovery and validation, Drug Disvoery Today: Technologies.(2006)3:293-300.
  • Development of new RNAi therapeutics, Histology and Histopathology. (2007)22:211-217.
書籍

參見

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